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初次接触糖尿病小鼠模亿电竞平台型,对这方面有些问题不

时间:2021-12-24 15:40:02 来源:网络整理 点击:

《STZ造模材料》
STZ 诱发糖尿病动物模型的原理
STZ对一定种属动物的胰岛β细胞有选择性破坏作用,能诱发许多动物产生糖尿病,一般采用大鼠和小鼠制造动物模型。国外有学者报道选用雄性大鼠制造模型的成模率明显高于雌性大鼠。1型糖尿病与2型糖尿病动物模型的制备与STZ注射的剂量有关系:大剂量注射时,由于直接引起胰岛β细胞的广泛破坏,可造成1型糖尿病模型;而注射较少量STZ时,由于只是破坏一部分胰岛β细胞的功能,造成外周组织对胰岛素不敏感,同时给予高热量饲料喂养,两者结合便诱导出病理、生理改变都接近于人类2型糖尿病的动物模型。

造膜前的喂养
Ⅰ型糖尿病模型成模比较快,通常大鼠在普通饲料适应性喂养2周后即可开始造模
Ⅱ型糖尿病模型:高脂饮食诱导加小剂量STZ。造模前喂以高脂(高糖)饲料,诱发出胰岛素抵抗。

高脂(高糖)饲料
高脂(高糖)饲料成分:其中含10%蔗糖,10%猪油,5%胆固醇
由基础鼠饲料加蔗糖、炼猪油和蛋黄按比搭配制作高脂高糖饲料:其比例为猪油18 % ,蔗糖20 % ,蛋黄3 % ,基础饲料59 %。

预实验的重要性
很重要。实验时STZ的给药量应参照预实验的结果,尽量不要盲目按照文献上或他人的给药量来直接使用,鼠均重和空腹(低糖状态)抗药力、禁食时长、注射选时、以及之前饲养过程、测糖选时等都不相同,通过预实验来确定符合自己实验鼠的给药计量,才是最科学的。

常用给药剂量
Ⅰ型糖尿病模型:大鼠剂量为70~65mg/Kg
Ⅱ型糖尿病模型:高糖高脂喂养1~2 个月的大鼠,STZ 剂量在25~40mg/Kg
    或参考文献(鼠均重不同,本剂量以200克均重为例)。

配置STZ液
柠檬酸缓冲液的配制: 柠 檬 酸(FW:210.14) 2.1g加入双蒸水100mL中配成A液 柠檬酸钠(FW:294.10)2.94g加入双蒸水100mL中配成B液
链脲佐菌素配制液:用时将A、B液按一定比例混合(1:1.32也有按1:1的),PH计测定ph值,调节ph=4.2-4.5,即是所需配置STZ的柠檬酸缓冲液。
注射时用柠檬酸缓冲液以1%的浓度溶解STZ,按空腹体重注射相应的STZ,  在30分钟内注射完毕。★ STZ容易失活, STZ快速称取后仍要求干燥避光,推荐用干燥铝箔(或锡箔)纸。

能否使用其他溶液配置缓冲液
可以。但我们推荐使用柠檬酸。例如用醋酸等溶液,也可以做出,但其PH值不好控制,而STZ只有在PH4.2-4.5的时候才具有最佳药力活性。

禁食和血糖的联系
禁食12小时以上(一般过夜禁食,不禁水)。禁食的时间越长,STZ对胰岛β细胞的破坏力越明显,即药效越高。所以相对禁食时间延长,可以降低STZ的用量。
腹腔注射和尾部注射的区别
尾部注射即静脉注射,药物利用率较高,同比腹腔注射,可以节省药量,缺点是操作起来不如腹腔注射方便。

注射前有那些操作步骤?
过夜禁食后称重,按大鼠总重量比称取STZ,放一干燥灭菌瓶内,外用锡纸包好,将柠檬酸缓冲液及装STZ的瓶子置冰浴,一起带到动物房,如果注射操作技术不熟练,应两组交替注射,建议分组溶解STZ,比如10只或15只鼠/组。

注射时,推进速度和血糖的关系
推注的速度快,更容易形成高血糖,推注的速度慢,相对的危险性较低,但也不容易成模,常规操作中多要求快速注射。当然,STZ的剂量是决定血糖高低的主要因素。

死鼠问题的解决
鼠的个体差别和空腹(低血糖)抵抗力的差异而致死亡率的不同,开始死亡率高可能主要是血糖突然升高,鼠不适应,或发生了DKA(即酮症酸中毒)。
首先,一定要保证足够的饮水量(饮水量不足容易导致死鼠);
其次,高血糖和低血糖都会造成死鼠,避免死鼠可以通过注射胰岛素或暂时补糖,两种途径: 1、常见为血糖过高。补胰岛素法,补一些中效胰岛素。例如给诺和灵n或NPH(中性鱼精蛋白锌胰岛素),每次2--3个单位,过了3-5天,大鼠一般死亡率就低了;2、补糖法,禁食后的鼠,注射的时候已经处于低血糖状态,造模4小时后腹腔注射百分之20的葡萄糖,可避免因注射时血糖过低死鼠;
再次,防止动物自相残杀。食物缺乏和供水不足的情况下,会互相撕杀、啃食同类,所以食物和饮水要供应充足,最好是两路供应;
最后,防止感染。糖尿病大鼠尿量多,垫料潮湿,需要勤换垫料,所以糖尿病大鼠较其他大鼠容易出现感染,特别是泌尿道感染和腹腔感染。腹腔注射、皮下注射及采血测血糖等侵入性操作前后,要注意消毒工作。如每次采血测血糖后可用四环素(或金霉素眼药膏)局部涂抹处理伤口预防感染。
模型不达标者,三天后补注STZ(以10mg-20mg/kg体重剂量腹腔注射),也很容易成模,或让血糖恢复正常后再常规剂量注射;但要达到理想的效果,往往是恢复到正常状态下重新造模。

STZ的保存方法
2-8℃,干燥避光保存。(注:本品易潮解,如需反复取量过程中,应避免接触其受水受潮,受潮后30分钟后失效,这和注射时要求其快速注射是一个道理,即其水溶液不稳定)。

多次称取STZ时的操作方法和注意事项
如确实需要多次称取,要严格按照避免受潮的原则操作和存放。
操作方法:操作环境、盛装容器、分装工具都必须保证干燥。无需冰浴,分装后用封口膜密封瓶口,用铝箔纸(或锡箔,即避光)将瓶子包好,放入干燥罐里(干燥剂,即保持干燥状态), 并2-8℃冷藏,可长期保存。本品保质期为3年半。

链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)对机体组织毒性相对较小,动物存活率高,是目前国内外使用较多的制备糖尿病动物模型的药物。北京博爱科贸有限公司(  010-83004443  13581988332 QQ:5640341), 为广大糖尿病研究人员提供高质量、低价格的-------链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ ,1g/瓶(灭菌装)¥900/g; 1g/瓶(普通装) ¥750/g; 5g/瓶¥700/g), min≥98.89, SigmaS0130)产品,使您的研究没有后顾之忧。
以上材料仅供参考,不承担任何数据责任,也真心希望能给您带来帮助,为糖尿病科学做些贡献。
1、试剂配制:
1.1 0.1mol/L pH4.4柠檬酸缓冲液的配制:
A液(0.1mol/L柠檬酸)—称取分析纯柠檬酸21.014g,用蒸馏水溶解并定容至1L;
B液(0.1mol/L柠檬酸钠)—称取柠檬酸钠29.412g用蒸馏水溶解并定容至1L;
取A液114ml与B液86ml混匀,即为0.1mol/L pH4.4的柠檬酸缓冲液;高压灭菌或δ22μm微孔滤膜过滤灭菌,冰箱中冷藏备用。
1.2 STZ的配制:
STZ用4℃的0. 1M无菌柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液(PH=4. 4 )配制,现用现配,避光冷藏,10min 内用完。 注意STZ有毒,需要带口罩和手套。注射剂量:100 mg/kg。注射方法:按每10g体重注射0.3ml,此时溶液的浓度是3.334mg/ml。或平均法注射(忽落个体间的体重差异),0.1ml/只,根据小鼠总量配制相应浓度。

2)就自己在糖尿病大鼠实验方面的个人体会,如下:
不管是四氧嘧啶还是STZ 造模,造模后的饲养是关键,我们一天要给大鼠换水四至五次,饲料喂三至四次(每次喂足够饲料),换水是早上7:00一次,白天随时补足,晚上10:00再给足水和饲料。还有有些动物的状态不是很好,可能抢不到足够的饲料和饮水,所以在饲养笼里也要注意加入适当的饲料。为了给足饮水,我们在大鼠饲养笼上再加一个水瓶架,就是比普通的饲养笼要多一个饮水口和双倍水量。
另外,光照也是影响糖尿病大鼠死亡的原因之一,光照不能太强烈,最好不要有太阳光出现,如有窗户的房间要把窗户用纸糊起来。
我本人的经验是饲料要保持干燥,潮湿后长霉菌DM鼠易腹泻;正常鼠可饮自来水,而DM鼠要给烧开过的水,这样不容易感染;此外垫料必须一天换一次,室内要勤消毒。刚开始我都没注意这些方面,结果一个月死了13只,后来严格注意,近一个月一只未死。

一定要给糖尿病大鼠多饮水,否则很容易死亡。要看到没了,就应放上。这个剂量应该可以,最好稍微减少1mg左右。
死亡原因可能有以下几点:
①大鼠太小,也就是大鼠体重不够,容易引起死亡。②不知道你用的是什么大鼠,SD?Wistar?如果是后者,死亡就更多了(只是个人经验,还没有得到具体实验的证实,仅作参考)。③还有就是在造模后一定要加足水和饲料,而且要注意大鼠的饲养环境,要保持尽量干净,光照不能太强(避免有太阳光)!
我认为在造模后24小时内死亡的主要原因是胰岛细胞破坏后胰岛素大量释放导致的低血糖而亡,你不妨拿少量大鼠作个预实验,测测血糖看看,解决的办法可在STZ注射后给予0.5%GS饮水。充足的饮水和保持敷料干燥是成模后减少死亡的方法。
STZ制造的大鼠糖尿病模型死亡可能原因
①大鼠前一晚是否禁食。②STZ的剂量是否过大,腹腔一般50~60mg/KG.BW,尾静脉注射应当小很多。③配制STZ柠檬酸缓冲液的PH值,配制STZ操作时是否在冰上操作。
一般来说采用STZ腹腔注射的情况不会导致大鼠的死亡。而且比较安全可靠。





成模标准:
(1)首先关键是糖尿病模型成模与否的鉴定,不少报道称造模后血糖有波动,建议持续观察。建议检测点:10d、2w、3-4w、5w,以明确血糖变化,确定模型建立时间。——推断相关疾病成模时间
STZ造模后,明显血糖水平波动呈现3个时相,一过性高血糖(1-2h)、短暂低血糖(6-10h)、持续高血糖(>72h)。必须适当补给胰岛素和葡萄糖。

(2)我也造了一批模型,雄性SD大鼠,体重控制子180-200g,STZ用量60mg/kg,配置方法根楼上的一样,而且我的PH值也没有像别的同学那样用酸碱仪测,只是用PH试纸而已。但是我觉得一周或十天成模的方法不可信,加预实验我样了80只SD大鼠,腹腔注射后十天成模率90%,2周左右成模了的大鼠大约有一半恢复,3-4周左右血糖又开始升高,大概5周左右,血糖开始稳定且比较稳定。血糖升高以后每天更换木糠,因为模型组尿量多,我经常是一天换两次,我的模型已经样了8周了,而且每天灌喂,目前情况还好,暂时还没有死亡,而且我一直没有使用胰岛素。

模型稳定性及持续时间
1、WISTAR大鼠(雌雄各半),200-300克体重,STZ用量,60mg/Kg。溶液:柠檬酸缓冲液(0.1mol/l,PH4.5)。腹腔注射。
2、缓冲液新鲜配制,溶解STZ后立即注射,别耽误太久了,腹腔注射注意勿入脏器。
3、12小时后,出现多饮症状,部分的血糖开始升高,7天后血糖大于16.65约80%。十天后90%
4、注射STZ后第二天开始,每天换垫料,注意充足的水及饲料。
5、雄鼠血糖持续偏高,目前已经4个月了,很稳定。雌鼠血糖不稳定,在一个月左右时间,血糖明显恢复,大部分血糖下降到10左右,持续约一月,又开始上升,达到成模标准,此后比较稳定,
失败原因分析
10天还没有成模型,可能要考虑一下:
1.腹腔注射的技术,是否注射到肠子里了
2.STZ的配制是否合适,用PH4.6左右的0.1M的柠檬酸缓冲液配制,现配现用,如果操作慢,最好放在冰浴里。
3.注射STZ之前是否禁食了,应该禁食12h左右。
建议,再观察3天,还是不成模型的话,重新注射一次。
 

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